La identificación masiva de transcritos se ha basado hasta ahora en la secuenciación por lecturas cortas de ADNc y posterior ensamblado del transcriptoma con algoritmos específicos. Sin embargo, esta aproximación limita la identificación de transcritos alternativos. La secuenciación de cadena larga podría aportar más información sobre la diversidad transcripcional y por ende proteica. Este estudio explora las posibilidades de RNA-Seq de cadena larga por nanoporo para definir la diversidad del transcriptoma hepático humano, centrado en la variabilidad de los genes de la hemostasia.

Gracias a una colaboración de tres grupos del IMIB, se secuenció el ARNm de hígado de 15 pacientes sometidos a cirugía bariátrica, empleando un dispositivo MinION y el kit SQK-RNA002. El ensamblado de novo se realizó con FLAIR v1.5.1 y GENCODE v39 como anotación de referencia. El resultado se filtró con SQANTI3 v4.1.3. Se seleccionaron los genes implicados en hemostasia según la ISTH (https://www.isth.org/page/GinTh_GeneLists). El estudio de las muestras fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca y los pacientes prestaron consentimiento informado.

La secuenciación generó 4,8M de lecturas con 789 bases de media, asignables a 11155 genes. Se identificaron 4570 nuevos transcritos potenciales, ausentes en GENCODE. Para los 98 genes de hemostasia se reportaron 183 isoformas de 63 genes, todas salvo 3 identificadas en dos o más pacientes. El 55% presentó más de una isoforma, siendo el más variable el del fibrinógeno gamma (FGG), con 15 (Fig.1A). La mitad de los transcritos ya estaban descritos, pero 92 eran completamente nuevos. Aunque un transcrito nuevo era resultados de la fusión de dos genes vecinos (PRSS53 y VKORC1), la mayoría (N= 91) se debieron a nuevas combinaciones de puntos de corte canónicos (Fig.1B). De estos, 48 presentaban retención intrónica y 43 distintas combinaciones de exones. Los modelos predictivos solo identifican potencial degradación por mutación terminadora en 20 de las nuevas formas. La mayor parte de transcritos de la hemostasia presentaron un nivel de expresión bajo (114, TPM<10), pero 69 (22 nuevos) tenían expresión media-alta.

La secuenciación de RNA por nanoporos duplica la diversidad transcripcional de las técnicas convencionales gracias a la secuenciación directa del ARN y las lecturas largas. Este estudio con 15 muestras de hígado humano identificó nuevos transcritos del sistema hemostático que podrían generar nuevas proteínas, ampliando la variabilidad de este sistema. La implicación fisiológica y patológica de esta nueva diversidad transcripcional, así como su impacto en terapias debe explorarse en nuevos estudios. Asimismo, estos resultados dan pie al uso de esta nueva tecnología en el descubrimiento de transcritos alternativos, no detectables por otras técnicas y que pueden ser de interés en el estudio de patología, abriendo de esta forma nuevas posibilidades de colaboración de nuestro equipo con otros grupos IMIB. Financiación: PI21/00174;PMP21/00052(ISCIII,FEDER,NG UE);PI20/00505;CP19/00098