Los retrotransposones (RT) son secuencias repetitivas muy abundantes en el genoma humano (42%), que tienen capacidad de transcribirse y reinsertarse. El movimiento de RT es clave en la evolución genómica pero también puede ser causa de enfermedades, al dar lugar a variaciones estructurales (VE) como inserciones, deleciones o duplicaciones. La dificultad de detección de estas variantes mediante métodos moleculares rutinarios y el impreciso mapa de RT en el genoma, sugieren que su implicación en enfermedades podría estar subestimada. La novedosa tecnología de secuenciación de lecturas largas mediante nanoporos, idónea para la identificación y caracterización de VEs, podría ayudar a redefinir el mapa de RT en el genoma humano e identificar RT en nuevas enfermedades. Los obetivos del estudio son identificar y caracterizar VEs y RTs en el genoma humano mediante secuenciación con nanoporos y valorar su posible implicación patogénica, en casos con dos desórdenes monogénicos en los que las técnicas moleculares convencionales no han identificado variantes patogénicas.

De un total de más de 500 pacientes con deficiencia de antitrombina de dos cohortes (España y Belgica), se seleccionaron 39 con VEs de SERPINC1 detectadas por MLPA y 11 sin alteración molecular que explique la deficiencia. Además, de 22 pacientes con Trombastenia de Glanzmann, se seleccionaron 2 en los que la secuenciación por NGS de los genes candidatos (ITGA2B y ITGB3) no identificaron ninguna alteración molecular patogénica. . La secuenciación por nanoporos del genoma se realizó mediante PromethION (genoma completo) o MinION (enriquecimiento de regiones seleccionadas). Se desarrollaron dos pipelines informáticas específicas para la búsqueda de VEs y para la detección de nuevas inserciones o deleciones de RTs que incluían genotipado para definir frecuencias alélicas.

La secuenciación por nanoporos identificó y caracterizó a nivel nucleotídico todas las VEs responsables de deficiencia de antitrombina, independiente del tipo (deleciones, la mayoritaria: 83,1%; duplicaciones; e inserciones de RT) o tamaño (de 193pb a 8Mb). Todas las VEs excepto 2, implicaban RTs y/o microhomologías en los puntos de corte. (Figura 1) El análisis del genoma completo detectó 7.787 diferentes nuevas inserciones de RTs. Mayoritariamente eran RT de clase I, y especialmente Alu. La mayoría (5.230, 67.2%) de los nuevos RT se identificaron en más de un paciente, sugiriendo que puedan ser polimorfismos. 4.023 nuevas inserciones de RT afectaban directamente a 2.889 genes, caracterizados por su alto contenido de secuencias repetitivas. El análisis de enriquecimiento identificó genes implicados en enfermedades del espectro autista y cáncer. Seis inserciones se produjeron en regiones codificantes de 6 genes. Finalmente, el análisis de los casos sin base molecular detectó la inserción de un RT en 2 de los 11 casos con deficiencia de antitrombina, y una VE compleja que afectaba al gen ITGB3 en los dos casos con Trombastenia de Glanzmann. (Figura 2)

La secuenciación del genoma mediante nanoporos es el método idóneo para la caracterización de VEs, demostrando la implicación de RTs. Este método permite definir con mayor precisión el mapa de los RTs en el genoma humano que está aún por determinar. Esto permitirá identificar aquellas nuevas inserciones o deleciones con implicaciones patogénicas, que puede identificar la base molecular de otras enfermedades genéticas no detectadas con otros métodos. Financiado por PI21/00174 y PMP21/00052 (ISCIII, FEDER, NG UE).